Un equipo internacional de investigadores ha realizado un estudio que proporcionará información relevante sobre el desarrollo de posibles tratamientos para enfermedades neurológicas y relacionadas con la obesidad, entre otras afecciones humanas.
Ejemplar de Macaca fascicularis.
14 de abril de 2022, 09:22 | Actualizado a
Un equipo internacional de investigadores acaba de publicar el primer atlas transcriptómico de células de todo el cuerpo de primates no humanos del mundo en Nature, lo que representa un avance científico que podría llevar conducir al tratamiento de enfermedades que afectan a los seres humanos. Según Pura Muñoz-Cánoves, de la Universidad Pompeu Fabra, una de las autoras del estudio, “el esfuerzo realizado por nuestros colegas en China es extraordinario: han generado un atlas que abarca más de un millón de células de 45 tejidos del primate no humano (NHP) adulto Macaca fascicularis”.
Herramienta indispensable para prevenir enfermedades
Utilizando la plataforma de secuenciación de bibliotecas unicelulares DNBelab C4, desarrollada de forma independiente por el BGI-Research (una organización de secuenciación del genoma con sede en Shenzhen, China), los investigadores completaron el transcriptoma (conjunto de moléculas de ARN mensajero y de ARN no-codificante presentes en una célula o tejido concreto) unicelular de 45 tejidos y órganos de macacos de cola larga (cynomolgus), obteniendo un total de 1,14 millones de datos unicelulares e identificando 113 tipos de células principales. La tecnología propia de BGI-Research permitirá a los científicos llevar a cabo análisis unicelulares extensos y multidimensionales con enorme precisión.
La tecnología propia de BGI-Research permitirá a los científicos llevar a cabo análisis unicelulares extensos y multidimensionales con enorme precisión.
Los primates como los macacos son las especies más cercanas a los humanos en el árbol evolutivo. Al cartografiar el transcriptoma del macaco a nivel unicelular, los científicos disponen ahora de una base de datos, o biblioteca unicelular, que puede utilizarse para desarrollar métodos de diagnóstico y tratamiento de enfermedades, evaluar la eficacia de los fármacos clínicos, analizar la evolución celular entre especies y las funciones cognitivas avanzadas del cerebro.
Atlas atlas transcriptómico de células del Macaca fascicularis.
Este mapeo de células individuales ha permitido al equipo identificar los tipos de células que pueden contribuir a causar diversas enfermedades en los humanos o hacer que los individuos sean más susceptibles a una determinada enfermedad. Por ejemplo, en el caso del Covid-19, la mayor manifestación de la enfermedad es la neumonía, porque el SARS-CoV-2 infecta a un pequeño grupo de células en el pulmón. Sin embargo, el mapeo unicelular del macaco también logró identificar ciertas células en otros tejidos que pueden infectarse en los primates. Esto podría ayudar a los médicos a entender dónde buscar signos de Covid-19.
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Por otra parte, el mapeo unicelular también puede ayudar a identificar qué células metabolizan las calorías de la grasa, lo que facilitará a los investigadores la comprensión de los factores ocultos que contribuyen a la obesidad en humanos. Asimismo, este proceso podría ayudar a identificar qué células son las encargadas de regular los circuitos neuronales en el cerebro, lo que conduciría a posibles tratamientos para enfermedades neurológicas.“Este atlas va a ser muy valioso para comprender los tejidos que carecen de suficiente número de células, estableciendo comparaciones adaptativas entre especies y prediciendo la susceptibilidad a las enfermedades”, concluyen los investigadores.
El mapeo unicelular también puede ayudar a identificar qué células metabolizan las calorías de la grasa, lo que facilitará a los investigadores la comprensión de los factores ocultos que contribuyen a la obesidad en humanos.
Ejemplar adulto de Macaca fasciluris o Macaco Cangrejero.
El equipo está formado por investigadores del BGI-Research, la Universidad de Jilin y los Institutos de Biomedicina y Salud de Guangzhou (Academia China de Ciencias), junto con otros equipos pertenecientes a 35 instituciones internacionales, entre las que se encuentra la Universidad Pompeu Fabra (UPF) a través del Grupo de Investigación en Biología Celular del Departamento de Medicina y Ciencias de la Salud (MELIS), liderado por Pura Muñoz-Cánoves, catedrática de la UPF y profesora ICREA, CIBERNED y del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares-CNIC.
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Resumen
Estudiar la composición y función de los tejidos en primates no humanos (NHP) es crucial para comprender la naturaleza de nuestra propia especie. Aquí presentamos un atlas transcriptómico celular a gran escala que abarca más de 1 millón de células de 45 tejidos del adulto NHP Macaca fascicularis . Este conjunto de datos proporciona un vasto recurso anotado para estudiar una especie filogenéticamente cercana a los humanos. Para demostrar la utilidad del atlas, hemos reconstruido las redes de interacción célula-célula que impulsan la señalización de Wnt en todo el cuerpo, mapeado la distribución de receptores y correceptores para virus que causan enfermedades infecciosas humanas e intersectado nuestros datos con ortólogos de enfermedades genéticas humanas. para establecer posibles asociaciones clínicas. Nuestro m . fascicularis atlas celular constituye una referencia esencial para futuros estudios en humanos y NHPs.
Principal
Un obstáculo importante para construir un atlas completo de células humanas 1 es obtener una gama completa de muestras de "alta calidad" de tamaño suficiente. Dada su proximidad evolutiva, los primates no humanos (NHP) representan la alternativa más cercana a los humanos. La generación de un atlas de células NHP (NHPCA) produciría un catálogo de características que podrían usarse para estudiar la fisiología humana, la enfermedad y el envejecimiento. También proporcionaría información sobre los mecanismos evolutivos que subyacen a las diferentes funciones corporales entre los NHP y los humanos.
Los NHP comprenden un grupo grande y diverso de especies con importantes diferencias ecológicas, dietéticas, locomotoras y de comportamiento 2 . Debido a sus características, que incluyen un ciclo reproductivo más frecuente y una amplia disponibilidad, los macacos, en particular Macaca fascicularis (también conocido como cynomolgus, cangrejero o mono de cola larga), ahora se utilizan con fines de investigación en todo el mundo 3 . Aquí usamos adultos M . fascicularis tejidos para generar el conjunto de datos transcriptómicos de células NHP más grande hasta el momento. Para facilitar la exploración de este recurso, hemos creado el sitio web de la NHPCA, una base de datos abierta e interactiva ( https://db.cngb.org/nhpca/ ).
Generación de un atlas de células de mono adulto
Aislamos células / núcleos para 45 muestras de tejido diferentes de cinco monos machos y tres hembras de 6 años (Fig. 1a , Fig. 1 complementaria y Tabla complementaria 1a ). La mayoría de los tejidos se perfilaron mediante secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq), que elude las complicaciones asociadas con los protocolos de disociación y nos permitió perfilar muestras congeladas, pero para algunos tejidos usamos secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq). El ganglio linfático se perfiló utilizando tanto scRNA-seq como snRNA-seq para comparar. Todos los experimentos utilizaron la plataforma basada en gotitas DNBelab C4 para la generación de bibliotecas 4 . Después del filtrado, conservamos los datos transcriptómicos para un total de 1 144 706 células/núcleos (Fig. 1a), con números que van desde 84.619 en el cerebelo hasta 2.694 en la vagina (Tabla complementaria 1a ). Para los ganglios linfáticos, la comparación entre scRNA-seq y snRNA-seq identificó una cantidad similar de genes e identificadores moleculares únicos (UMI) (Fig. 2a-f complementaria ). Del mismo modo, la integración de grupos de células mostró una buena coincidencia entre los dos métodos, aunque snRNA-seq fue más eficiente para capturar tipos de células menos abundantes. Estos resultados confirman la utilidad de snRNA-seq para generar atlas de células a gran escala 5 , 6 .
a , Izquierda, representación esquemática de los tejidos de mono analizados en este estudio. Los dibujos animados utilizados para generar este diagrama esquemático se compraron en BioRender.com. Se recogieron un total de 45 tejidos de 3 monos hembras y 5 machos de 6 años. Se muestra una visualización de UMAP del agrupamiento global de todas las células del conjunto de datos coloreado por tejido (centro), y los gráficos de barras muestran el número de células/núcleos perfilados para cada tejido después del control de calidad (derecha). n = 1.144.706 células/núcleos individuales analizados. b, Visualización UMAP de todos los grupos coloreados por los principales tipos de células. Se identificaron un total de 113 grupos de células en el conjunto de datos. La anotación del tipo de celda para todos los grupos principales se proporciona en la leyenda de la derecha; NKT, asesino natural T; OPC, célula progenitora de oligodendrocitos. Datos fuente
En la visualización global del agrupamiento de células utilizando la aproximación y proyección de colector uniforme (UMAP), cada tejido tendía a agruparse por separado, y los del mismo sistema generalmente se agrupaban más cerca entre sí (Fig. 1a y Figs. Suplementarias 3 - 7 ). Sobre la base de los niveles de expresión de marcadores específicos (Fig. 8 complementaria ), definimos 113 grupos de células en la vista UMAP global de todos los tejidos (Fig. 1b y Tabla complementaria 1b, c ). En promedio, detectamos 1445 genes y 2583 UMI por célula/núcleo (Fig. 9 complementaria). El número de células para cada uno de estos 113 tipos de células osciló entre 76 602 para células granulares en el cerebelo y 21 para oligodendrocitos en la glándula pineal (Fig. 10 complementaria ). De manera tranquilizadora, muchos de los 113 grupos estaban compuestos en gran parte por un tipo de célula perteneciente a un tejido específico (Fig. 1b y Fig. 11a complementaria ). Sin embargo, los tipos de células como endoteliales, estromales y varias células inmunitarias se compartieron entre diferentes tejidos, como se esperaba (Figura complementaria 11b). A continuación, generamos representaciones UMAP individuales para cada tejido y aplicamos el agrupamiento de Seurat basado en gráficos imparciales, identificando 463 grupos de células en todos los tejidos. En las Figs. complementarias se proporciona una anotación detallada de las poblaciones de células detectadas en cada tejido. 12 - 15 y Tabla Suplementaria 1d, e . Nuestro m . fascicularis atlas se puede buscar de forma interactiva por tejido, tipo de célula y gen a través del sitio web de NHPCA.
Para demostrar el potencial de las comparaciones entre especies, seleccionamos un total de 12 tejidos NHP superpuestos con atlas de células de ratón unicelular (Mouse Cell Atlas, MCA) y humano (Human Cell Landscape, HCL) 7 , 8 (Figs. 16 complementarias). – 19 y Tabla Suplementaria 1f). El número de células, así como las tasas de captura de genes y UMI fueron mayores en NHPCA para los 12 tejidos. Observamos una buena correlación de los genes marcadores de tejido con los conjuntos de datos humanos y de ratón en todos los casos. Asimismo, el número de tipos de células principales detectados fue aproximadamente comparable en las tres especies (111 en monos, 110 en ratones y 106 en humanos), pero con diferencias en las proporciones. Por ejemplo, más del 80% de las células hepáticas detectadas en monos correspondían a hepatocitos, en línea con la proporción normal del 60-80% en este tejido 9 , 10, pero solo el 3% y el 6,7% de las células correspondientes eran hepatocitos en hígado humano y de ratón, respectivamente. Esta discrepancia podría estar relacionada con un sesgo en la captura de la población celular cuando se utilizan diferentes plataformas o el uso de núcleos frente a células enteras. Realizamos la inmunotinción de secciones de hígado de mono para la albúmina marcadora de hepatocitos, observando como se esperaba que la mayoría de las células eran positivas (Fig. 20a complementaria ). Los genes expresados diferencialmente (DEG) entre poblaciones de células de tejido específicas en los tres conjuntos de datos se pueden examinar utilizando nuestro sitio web. Como prueba del principio de la aplicación para estudiar las interacciones célula-célula en todo el cuerpo, examinamos la distribución de los receptores de insulina y glucagón en los 12 tejidos (Figura complementaria 20b). Aunque los patrones fueron similares, se observaron diferencias específicas de especie. Las interacciones ligando-receptor adicionales en cada uno de los 45 tejidos de mono y la comparación entre especies para los 12 tejidos compartidos también se pueden explorar usando nuestro sitio web, y hemos proporcionado una opción para cargar conjuntos de datos de tejidos individuales para permitir comparaciones personalizadas.
Tipos de células comunes en todos los tejidos
Inspeccionamos tipos de células comunes que pueblan diferentes tejidos en todo el cuerpo del mono 8 , 11 , 12 , 13 . Primero, combinamos y reagrupamos selectivamente células del estroma, macrófagos (incluida la microglía), células endoteliales y células del músculo liso de todos los tejidos analizados. Aunque se observó una diversidad considerable, muchos grupos de células se agruparon en función del origen del tejido (Fig. 21a-d complementaria ). También realizamos un análisis DEG para obtener firmas específicas de tejido, identificando una heterogeneidad sustancial (Fig. 21e-h complementaria y Tabla complementaria 2a-d ).
En particular, nuestros datos de snRNA-seq ofrecen la posibilidad de estudiar poblaciones celulares que no pueden caracterizarse mediante análisis de scRNA-seq convencionales, como los mionúcleos de fibras musculares esqueléticas multinucleadas. Combinamos y reagrupamos células de tejidos en nuestro atlas que se sabe que contienen células del músculo esquelético. Este enfoque identificó poblaciones distintas en la pared abdominal, el diafragma y la lengua, mientras que los núcleos del esófago eran más homogéneos (Fig. 2a ). Los mionúcleos en la pared abdominal, el diafragma y la lengua comprendían miofibras MYH7 + tipo I (contracción lenta) y MYH2 + tipo II (contracción rápida) 14 (Fig. 2b, c y Tabla complementaria 2e-g). Los umbrales diferenciales de expresión de MYH2 y GPD2 subdividieron aún más los mionúcleos tipo II en mionúcleos tipo IIa ( MYH2 alto ) y tipo IIb ( MYH2 bajo GPD2 + ). De acuerdo con informes anteriores, no detectamos mionúcleos tipo IIb en la lengua 15 . Además, los mionúcleos de la lengua tipo I y tipo IIa se agruparon muy cerca, lo que puede estar relacionado con que la lengua es un músculo altamente inervado.
a , Visualización UMAP del agrupamiento global de células del músculo esquelético. Los racimos están coloreados por tejido (pared abdominal, diafragma, esófago y lengua). b , representación UMAP de todas las células musculares esqueléticas reagrupadas coloreadas por subtipo. c , visualización UMAP de marcadores específicos utilizados para identificar mionúcleos tipo I ( MYH7 ), tipo IIa ( MYH2 ) y tipo IIb ( GPD2 ), FAP ( LVRN ), núcleos MTJ ( NAV3 y COL22A1 ), núcleos NMJ ( ETV5 y MUSK ) y celdas satelitales ( PAX7 ), como se muestra en b. Debido a sus pequeñas proporciones, las últimas cuatro poblaciones se indican con una flecha roja. d , Gráficos de barras apiladas que representan las proporciones de núcleos de músculo esquelético (subtipos de mionúcleo tipo I, tipo IIa y tipo IIb, núcleos MTJ y NMJ, y células satélite y FAP) en los tejidos indicados. e , Mapa de calor que muestra los DEG entre las poblaciones de músculo esquelético resaltadas en d . f , Gráficos de burbujas que muestran los DEG para cada uno de los subtipos de mionúcleos que comparan diferentes tejidos. gramo, visualización UMAP de células mesoteliales (meso) de tejidos seleccionados (glándula suprarrenal, vejiga, diafragma, trompa de Falopio, ovario y tejido adiposo visceral). La línea roja discontinua indica cuatro grupos diferentes de células mesoteliales pertenecientes al tejido adiposo visceral. h , Gráficos de violín que muestran la expresión diferencial de marcadores mesoteliales e inmunitarios en los grupos de tejido adiposo visceral resaltados por la línea roja discontinua en g . i , visualización UMAP de tres grupos diferentes de células mesoteliales del ovario. Las células mesoteliales, las células epiteliales de superficie (epi de superficie) y las células epiteliales de tipo progenitor (epi de tipo prog) se resaltan en rojo, azul y amarillo, respectivamente. j , Visualización UMAP deExpresión de LGR5 en células mesoteliales de ovario. k , Gráficos de violín que muestran los DEG entre las tres poblaciones de células mesoteliales de ovario resaltadas en la visualización de UMAP. Datos fuente
Los umbrales diferenciales de expresión de MYH2 y GPD2 subdividieron aún más los mionúcleos tipo II en tipo IIa ( MYH2 alto ) y tipo IIb ( MYH2 bajo GPD2 + ). Además, discriminamos, aunque en proporciones bajas, los núcleos de la unión neuromuscular (NMJ) NAV3 + en el diafragma y los núcleos de la unión miotendinosa (MTJ) ETV5 + tanto en la lengua como en el diafragma (Fig. 2b-d ). Además, detectamos núcleos PAX7 + de células satélite en la lengua y el diafragma, mientras que un pequeño grupo de LVRN +Los progenitores fibroadipogénicos (FAP) podrían anotarse en el diafragma, la pared abdominal y el esófago. Los núcleos del músculo esquelético exhibieron firmas de expresión génica específicas de subtipo y tejido y términos de ontología génica (GO) (Fig. 2e, f y Fig. 22a-c complementaria ). También observamos una heterogeneidad sustancial de mionúcleos dentro del mismo subtipo y tejido (Fig. 2f ).
Luego, para estudiar la heterogeneidad entre los adipocitos, combinamos y reagrupamos células de tejidos adiposos subcutáneos y viscerales, lo que resultó en nueve grupos principales (Fig. 23a-d complementaria ). Notamos una marcada distinción entre adipocitos maduros y supuestos progenitores de adipocitos, como se refleja en la expresión diferencial de ADIPOQ y CD34 . Los adipocitos maduros subcutáneos y los progenitores de adipocitos se enriquecieron para la expresión de FOS . Asimismo, SLC11A1 y SPOCK3 marcaron adipocitos subcutáneos y viscerales maduros, respectivamente. Los progenitores de adipocitos estaban compuestos por dos poblaciones para tejido visceral ( WT1 + ITLN1 + yCFD alto WT1 bajo ITLN1 – ), tres poblaciones para tejido subcutáneo ( ESR1 + , CXCL14 + APOD + y DPP4 + ) y una población compartida por ambos tejidos ( NOX4 + ). Estos resultados son consistentes con los marcadores descritos en informes anteriores 16 , 17 , 18 , 19 . Validamos la coexpresión de CD34 y NOX4 en un subconjunto de progenitores de adipocitos de tejido adiposo subcutáneo y visceral mediante inmunotinción (Figura complementaria 24a, b). El análisis de pseudotiempo caracterizó la trayectoria de la maduración de los adipocitos a partir de los progenitores tanto en el tejido adiposo subcutáneo como visceral (Figuras complementarias 24c, d ). No detectamos una proliferación sustancial en ninguna de las poblaciones progenitoras sobre la base de la expresión del marcador de ciclo pan MKI67 (Fig. 23c complementaria ), lo que sugiere que estas poblaciones no son transitorias.
Finalmente, combinamos y reagrupamos todos los tejidos que contenían células mesoteliales, un tipo de célula epitelial especializada. Las células mesoteliales de la vejiga, el ovario y la trompa de Falopio estaban muy próximas, mientras que las de otros tejidos se agrupaban más separadas (Fig. 2g ). También detectamos heterogeneidad de células mesoteliales dentro del tejido, en particular para el tejido adiposo visceral y el ovario. En el primero, observamos un grupo de células mesoteliales de tipo inmune que, además de la expresión de los marcadores mesoteliales típicos ( MSLN , ITLN1 y PKHD1L1 ), también expresaban altos niveles de marcadores de células inmunes (por ejemplo, PTPRC , IL7R y TRAC ) (Figura 2h). Esto está de acuerdo con el concepto emergente de que las células estructurales tienen propiedades inmunitarias 8 , 11 y el papel inmunomodulador conocido del tejido adiposo visceral en las respuestas a las bacterias intestinales 20 . En el ovario, identificamos una población mesotelial clásica y dos poblaciones similares a PAX8 + (ref. 21 ) cercanas (una madura y otra similar a un progenitor) de origen mesotelial (Fig. 2i-k ). Previamente se han informado células epiteliales de ovario similares a progenitores 22 . En línea con trabajos previos, observamos que expresaban marcadores de células madre bien conocidos como LGR5 (ref. 22 ) y CD44(referencia 23 ). La inmunotinción para CD44 y la hibridación in situ con fluorescencia de molécula única (smFISH) para LGR5 confirmaron su coexpresión en un subconjunto de células epiteliales de superficie de mono (Fig. 24e complementaria ). El análisis de pseudotiempo reconstruyó la trayectoria desde las células progenitoras hasta las células epiteliales ováricas (Fig. 24f complementaria ). Al igual que en el tejido adiposo, no detectamos una proliferación sustancial en células epiteliales de ovario de tipo progenitor sobre la base de la expresión de MKI67 .
Estos hallazgos se suman sustancialmente a estudios previos de heterogeneidad de tipos de células comunes y firmas moleculares específicas de tejido 8 , 11 , 12 , 13 . Nuestro conjunto de datos proporciona un nuevo recurso interactivo para diseccionarlos más, aclarar los mecanismos subyacentes y estudiar las diferencias entre especies.
Componentes de señalización Wnt en los tejidos.
Un atlas de cuerpos celulares de grandes dimensiones es ideal para investigar las interacciones multifacéticas célula-célula, incluidas las que se producen en las vías de señalización mediadas por citocinas o factores de crecimiento. Además de desempeñar funciones esenciales en el desarrollo embrionario, los factores Wnt controlan el crecimiento y el mantenimiento de numerosos tejidos a lo largo de la vida. Por lo tanto, realizamos una encuesta de los componentes de la ruta Wnt 24 en todo el cuerpo del mono para diseccionar a fondo las células objetivo e identificar potencialmente poblaciones previamente no apreciadas.
Las proteínas LGR (LGR4, LGR5 y LGR6) actúan como amplificadores de las señales Wnt al inhibir los reguladores negativos 25 . En consecuencia, LGR5 y LGR6 a menudo marcan y regulan las células con función homeostática o de células madre adultas en tejidos específicos de mamíferos, mientras que LGR4 tiene una función menos conocida 26 . Observamos la expresión de LGR5 en múltiples tejidos de mono, con los niveles más altos en mionúcleos del músculo esquelético tipo I, células epiteliales del útero y la trompa de Falopio, células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) y células del túbulo renal (Fig. 3a ). Hasta donde sabemos, con la excepción de las células epiteliales en el útero y la trompa de Falopio 25, no se ha informado previamente que estos tejidos contengan cantidades sustanciales de células LGR5 + en mamíferos adultos. En este sentido, vale la pena señalar que la mayoría de los informes de células LGR5 + hasta el momento se han realizado en modelos de ratones modificados genéticamente debido a la falta de herramientas y reactivos específicos para estudiar otros mamíferos 25 . La expresión de LGR6 fue más restringida (Fig. 25a complementaria ), con mayor abundancia en cardiomiocitos, células foliculares tiroideas, células foliculoestelares de la glándula pituitaria y, como se informó anteriormente, células del músculo liso 27 . También detectamos LGR5 + o LGR6 +células en otros tejidos, incluso en tejidos informados previamente (por ejemplo, células epiteliales de ovario 22 , hepatocitos 28 y enterocitos de colon 29 ) y tejidos no informados (por ejemplo, células LGR5 + en células bipolares de la retina neurosensorial) (Figs. 26 complementarias - 30 y Tabla Suplementaria 3 ). En general, la expresión de LGR5 y LGR6 no se superpuso, excepto en las células epiteliales de las trompas de Falopio y las células del músculo liso de la vesícula biliar (Fig. 25b complementaria ). Además, hubo poca superposición entre LGR5 + o LGR6+ células con las que expresan MKI67 , además de células epiteliales de la trompa de Falopio y útero y células basales de la glándula salival. En contraste con LGR5 y LGR6 , LGR4 se expresó de manera ubicua en la mayoría de los tejidos (Fig. 25c complementaria )....................................... continúa
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