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********** Blog Fundado el 03 de Enero del 2008 **********
Hola amigos: A VUELO DE UN QUINDE EL BLOG., las neuronas humanas es un mundo que aún continúa en estudios e investigaciones por los neurocientíficos, que solamente a través del acceso al tejido neuronal humano en vivo, algo casi imposible de lograr, salvo con conocimientos de los pacientes de epilepsia, se puede estudiar los circuitos neuronales.... siga leyendo....
A través del acceso al tejido neuronal humano vivo es posible identificar algunas de las características funcionales que hacen de las neuronas humanas únicas. Por ejemplo, cómo funcionan sus circuitos neuronales.
Editor y periodista especializado en ciencia y naturaleza
El estudio in vivo del tejido neuronal humano es una práctica muy poco habitual. Para llevar a cabo este tipo de investigaciones científicas se requieren pacientes dispuestos a participar en los estudios, neurocirujanos que recolecten y entreguen las muestras en buenas condiciones, neurocientíficos especializados que además cuenten con las instalaciones de investigación y la tecnología necesarias para estudiar estos tejidos, además de especialistas en ética que velen con las máximas garantías por los derechos y la seguridad de los pacientes. Es por ello que el trabajo llevado a cabo por científicos del Instituto Krembil de Neurociencias y el Centro para el estudio de la Adicción y la Salud Mental -CAMH- de Toronto, podría ser revolucionario. Se trata de una investigación en la que, valiéndose del acceso poco común a estudio de tejido cortical humano vivo, han logrado identificar algunas de las características funcionales más importantes que hacen que nuestras neuronas sean únicas. Los resultados fueron publicados en un artículo titulado "Diversity amongst human cortical pyramidal neurons revealed via their sag currents and frequency preferences".
"El objetivo de este estudio fue comprender qué hace que las células del cerebro humano sean 'humanas' y cómo funcionan sus circuitos"
La investigación fue una de las primeras de su tipo llevado a cabo en neuronas humanas vivas y uno de los más grandes realizados sobre la diversidad de células piramidales corticales humanas hasta la fecha. También conocidas como neuronas piramidales, estas células, cuyo descubrimiento y primeros estudios debemos a Santiago Ramón y Cajal, se hallan en diversas partes del cerebro, como la corteza cerebral, el hipocampo o la amígdala. De ellas se sabe que son fundamentales en el control motor y se cree que juegan un papel muy importante en mayoría de tareas cognitivas complejas como la expresión de la personalidad, los procesos de toma de decisiones o la adecuación del comportamiento social a cada momento.
"El objetivo de este estudio fue comprender qué hace que las células del cerebro humano sean 'humanas' y cómo funcionan sus circuitos" declara el neurocirujano Taufik Valiante, científico adscrito al Instituto Krembil de Neurociencias y coautor principal del artículo que se publica en la revista Nature Communications. "Queríamos comprender cómo las células piramidales humanas, la clase principal de neuronas en el neocórtex, difieren entre las capas superior e inferior del este", añade el coautor de estudio, el doctor Shreejoy Tripathy, del Centro Krembil de Neuroinformática en el CAMH. "En particular, queríamos comprender cómo las características eléctricas de estas neuronas podrían apoyar diferentes aspectos de la comunicación entre capas y la generación de ritmos cerebrales, de los cuales, sabemos que se interrumpen en ciertas enfermedades cerebrales como la epilepsia", matiza.
"En la actualidad se sabe poco acerca de las formas y propiedades eléctricas de las neuronas humanas adultas vivas debido a la rareza de obtener tejido cerebral humano vivo, ya que aparte de las cirugías realizadas para el tratamiento de la epilepsia, existen muy pocas oportunidades para obtener este tipo de muestras" explica Valiante. Sin embargo, durante una cirugía rutinaria en pacientes con epilepsia y tumores, previo consentimiento de los mismos, el equipo empleó el tejido cerebral extraído para caracterizar la morfología y propiedades de las células individuales dentro de varios cortes de tejido cerebral.
En total, el equipo pudo analizar más de 200 neuronas de 61 pacientes, lo que refleja el mayor conjunto de datos de su tipo obtenidos hasta la fecha y encapsula casi una década de trabajo minucioso. Tras un examen inicial, los miembros del Centro Krembil de Neuroinformática utilizaron nuevos análisis de datos a gran escala para identificar las propiedades que distinguían a las neuronas de esta cohorte entre sí. Luego los resultados se compararon con los de otros centros que realizan un trabajo similar con muestras de tejido cerebral humano, como el Instituto Allen de Ciencias del Cerebro en Seattle, Washington.
Entre sus conclusiones, el equipo de Valiante y Tripathy descubrió que existe una enorme diversidad entre las células piramidales neocorticales humanas, así como que dependiendo de su posición en el neocórtex, también difieren en su comportamiento eléctrico y fisiológico. También encontraron diferencias notables e inesperadas entre sus hallazgos y experimentos similares en modelos preclínicos con animales, algo que el doctor Tripathy cree que probablemente refleja la expansión masiva del neocórtex humano en comparación con otros mamíferos y primates. "Los resultados también nos proporcionan una hipótesis plausible para la generación de ritmos theta corticales humanos - oscilaciones electromagnéticas detectadas en el cerebro humano generalmente asociadas al sueño- impulsados por neuronas de capa profunda", añade por su parte la autora principal del artículo, la doctora Homeira Moradi Chameh, del departamento de Neurociencia Clínica y Computacional del Instituto Krembil de Neurociencias
"Este conjunto de datos único nos permitirá construir modelos computacionales del cerebro humano de un valor incalculable para el estudio de neuropatologías puramente humanas", comenta otro de los coautores del estudio, el doctor Scott Rich, investigador postdoctoral en el laboratorio del Dr. Valiante. "Por ejemplo, se sabe que las propiedades celulares que impulsan muchas de las características únicas identificadas en estas neuronas se alteran en ciertos tipos de epilepsia. Al implementar estas características en modelos computacionales, podremos estudiar cómo estas alteraciones afectan, a diversas escalas espaciales en el cerebro humano, las dinámicas relacionadas con la epilepsia. Posteriormente, la traducción de estos hallazgos de 'ciencia básica' en potenciales aplicaciones clínicas podría a abrir la puerta a nuevas vías para la investigación y el tratamiento de esta terrible enfermedad", concluye.
En la neocorteza humana, las oscilaciones theta interlaminares coherentes son impulsadas por capas corticales profundas, lo que sugiere que las neuronas en estas capas exhiben propiedades electrofisiológicas distintas. Para caracterizar este carácter distintivo potencial, utilizamos registros de células enteras in vitro de las capas corticales 2 y 3 (L2 y 3), la capa 3c (L3c) y la capa 5 (L5) de la corteza humana. En todas las capas observamos una heterogeneidad notable, lo que indica que las neuronas piramidales corticales humanas son una población electrofisiológicamente diversa. Las células piramidales L5 son las más excitables de estas neuronas y exhiben la corriente de caída más prominente (abolida por el bloqueo de la corriente catiónica activada por hiperpolarización, I h). Si bien la resonancia subumbral es más común en L3c y L5, rara vez observamos esta resonancia a frecuencias superiores a 2 Hz. Sin embargo, la ganancia dependiente de la frecuencia de las neuronas L5 revela que son más hábiles para rastrear las entradas de frecuencia tanto delta como theta, una característica única que indirectamente puede ser importante para la generación de oscilaciones theta corticales.
Introducción
Los estudios comparativos entre la fisiología neuronal cortical humana y de roedores han revelado propiedades únicas de microcircuitos y neuronas corticales humanas. A nivel celular, se ha demostrado que las neuronas humanas tienen propiedades morfológicas únicas 1 , capacitancias de membrana potencialmente reducidas 2 , mayor compartimentación dendrítica en células piramidales L5 de mechones gruesos 3 , densidades de canales h más altas en células piramidales L3 versus L2 4 y una tipo de célula neuronal totalmente único 5 , 6 . A nivel de microcircuito, los circuitos neocorticales humanos demuestran una actividad reverberante única 7 , diferentes reglas de plasticidad dependientes del momento de los picos en comparación con los circuitos neocorticales en roedores8 , y oscilaciones coherentes entre las capas corticales superficial y profunda 9 . Además, las correlaciones entre el cociente de inteligencia del paciente y las características celulares de las células piramidales de las capas 2, 3 y 4 humanas se han demostrado tanto en la cinética del potencial de acción (AP) como en la longitud y complejidad de los árboles dendríticos 10 .
Aunque la comprensión experimental de las propiedades biofísicas y sinápticas únicas de las neuronas sigue siendo un esfuerzo importante, los modelos computacionales y las formulaciones matemáticas de las neuronas y los circuitos son esenciales para describir y explicar la dinámica colectiva a nivel mesoscópico, como las oscilaciones 11 , 12 , 13 . De hecho, se ha postulado recientemente que se necesita “un conjunto de simuladores cerebrales basados en modelos de neuronas en diferentes niveles de detalle biológico” para “permitir el refinamiento sistemático de los modelos de red candidatos en comparación con los experimentos” 14. Por extensión, para crear simulaciones del cerebro humano y el microcircuito cortical, necesitamos modelos neuronales derivados de experimentos humanos directos. Por lo tanto, a medida que exploramos lo que es únicamente humano en el cerebro humano para, por ejemplo, hacer frente a la creciente carga social de las condiciones neurológicas y neuropsiquiátricas 15 , 16 , la infusión de modelos computacionales con propiedades microscópicas y mesoscópicas celulares y de circuitos derivadas de humanos será crítica. importante.
En este contexto, nuestros experimentos previos en cortes corticales humanos han demostrado que la actividad tipo theta espontánea, la oscilación más ubicua en el cerebro humano 17 , puede inducirse mediante la aplicación de agonistas colinérgicos y glutamatérgicos 9 . Observamos oscilaciones theta que eran coherentes entre las láminas corticales, con la capa profunda al frente de la fase en relación con la capa superficial 9 . También observamos un fuerte acoplamiento de frecuencias cruzadas entre la actividad theta y gamma alta que se moduló con la fuerza de la sincronía entre las láminas corticales 18 —llamada coordinación a través del acoplamiento fase-amplitud coherente 19. Dado el papel de las propiedades electrofisiológicas intrínsecas en la generación de oscilaciones 13 y el hallazgo de que la capa theta profunda conduce a la capa theta superficial en fase, razonamos que las neuronas de la capa profunda en el neocórtex humano probablemente estén dotadas de propiedades biofísicas distintas que les permitan "impulsar ” tal actividad interlaminar.
Una de las corrientes de membrana candidatas que se piensa que contribuye a las oscilaciones de baja frecuencia (<8 Hz) es la corriente catiónica activada por hiperpolarización o corriente h ( I h ) 3 , 4 , 20 , 21 . Esta corriente es importante para las oscilaciones y la actividad de marcapasos en una miríada de tipos de células, que van desde las neuronas del mesencéfalo y el hipocampo hasta las neuronas del marcapasos cardíaco 22 , 23 , 24 . De acuerdo con su papel en la contribución a la actividad resonante, un estudio reciente en la neocorteza humana demostró que I h parecía necesaria para la resonancia subumbral observada en las neuronas L3 4. Además, se ha informado que las neuronas de mechones gruesos en L5 de la neocorteza humana también muestran I h somática y dendrítica prominente y resonancia subumbral 3 . Sin embargo, evidencia transcriptómica reciente y comparaciones detalladas con células homólogas en roedores 25 han sugerido que estas neuronas extratelencefálicas (ET) de mechones gruesos son mucho más raras, lo que implica que nuestra comprensión de las propiedades electrofisiológicas de las neuronas piramidales L5 sigue siendo incompleta.
Con base en nuestros hallazgos previos de que la actividad de la capa profunda parece impulsar la actividad superficial en la corteza humana 9 , planteamos la hipótesis de que este papel "principal" en la generación de coherencia interlaminar puede atribuirse en parte a las diferentes propiedades intrínsecas de las neuronas de la capa profunda y de la capa superficial. En la búsqueda de esta hipótesis, buscamos obtener una comprensión más completa de las características de las neuronas piramidales corticales L5 humanas. Utilizamos grabaciones de células enteras para caracterizar las células piramidales en L2&3, L3c y L5, centrándonos en la amplitud y la cinética de I ha través de la tensión de caída. Además de las diferencias biofísicas clave que favorecen una mayor excitabilidad en las células piramidales L5 versus L2 y 3 humanas, encontramos que L5 y L3c demostraron amplitudes de voltaje de caída más grandes en relación con las células piramidales L2 y 3 en general. Sorprendentemente, aunque en nuestros experimentos se observó cierta resonancia por debajo del umbral a > 2 Hz, encontramos que esta característica es generalmente bastante rara entre las células piramidales en todas las capas. Sin embargo, encontramos que las células piramidales L5 mostraron una mayor ganancia dependiente de la frecuencia en las frecuencias delta y theta, lo que motiva nuestra presentación de un "motivo de circuito dinámico" (DCM) 13subyacente a cómo las neuronas L5 "conducen" theta cortical humana. Por último, encontramos una notable variabilidad de célula a célula en los parámetros electrofisiológicos muestreados de células piramidales registradas dentro de la misma lámina de acuerdo con estudios previos en humanos L2 y 3 4 , 26 , 27 y además revelan que esta variabilidad es especialmente grande en L5.
Resultados
Se obtuvieron grabaciones de pinzamiento de parche de células enteras de neuronas neocorticales humanas ubicadas en L2 y 3, L3c y L5 dentro de cortes de cerebro agudos recolectados de 61 pacientes. Los tejidos se obtuvieron principalmente de pacientes que se sometieron a cirugía de resección por epilepsia intratable farmacológicamente (consulte la Tabla 1 para obtener un resumen de los detalles de los pacientes). Para muchas de nuestras grabaciones, no anotamos nuestras células piramidales L2 y 3 como pertenecientes específicamente a L2 o L3, considerando que la mayoría de estos datos se recopilaron antes de la publicación de un artículo reciente que ilustra las características morfológicas y electrofisiológicas divergentes de estas neuronas en el ser humano. neocorteza 4. En consecuencia, más tarde registramos a partir de un conjunto específico de células piramidales en L3c (es decir, la parte más profunda de L3) para contrastar y comparar específicamente nuestros hallazgos con los de hallazgos anteriores 4 .
Tabla 1 Datos demográficos (para un subconjunto de 49 pacientes donde dicha información estaba disponible).
Tabla 1 Datos demográficos (para un subconjunto de 49 pacientes donde dicha información estaba disponible).
Diversas morfologías y propiedades de membrana pasiva de células piramidales en L2 y 3, L3c y L5
Para confirmar la orientación exitosa de las células piramidales, se llenó un subconjunto de neuronas con biocitina y se sometió a una reconstrucción morfológica posterior. La figura 1a muestra ejemplos de barridos electrofisiológicos de células piramidales L2 y 3, L3c y L5 con las correspondientes reconstrucciones morfológicas tridimensionales (3D).
a Ejemplo de reconstrucciones 3D (arriba) y trazas de voltaje (abajo) para células piramidales L2 y 3, L3c y L5 después de la inyección de corriente hiperpolarizante y despolarizante. La capa cortical y la posición relativa desde la superficie pial se anotan para cada celda reconstruida. Asterisco en una rama de la dendrita apical en la celda g con truncamiento (por lo demás, las morfologías de las dendritas no estaban visiblemente truncadas). b – d Potenciales de membrana en reposo ( p = 0,007) ( b ), resistencias de entrada ( p = 0,111) ( c ) y constantes de tiempo de membrana ( p < 0,0001) ( d ) para células piramidales en L2&3, L3c y L5. Barras de error en b – ddenotan la media y las desviaciones estándar (DE). Se utilizó ANOVA post hoc de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunn para la comparación estadística. L2 y 3 ( n = 56), L3c ( n = 15) y L5 ( n = 105). ** denota p = 0,007 y *** denota p < 0,001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.
Las reconstrucciones 3D revelaron una rica diversidad de morfologías de células piramidales humanas, en consonancia con recientes demostraciones detalladas de las distintas morfologías celulares de las neuronas corticales humanas en función de la lámina cortical 1 , 3 , 4 , 26 . Las células piramidales con somas ubicados en L2 y la parte superior de L3 tenían dendritas basales complejas, con dendritas apicales que a menudo llegaban a L1. Las células piramidales ubicadas en L3c mostraron diferentes morfologías, con una célula (célula d) mostrando dendritas basales simples y otra (célula e) mostrando dendritas basales mucho más complejas, en consonancia con informes recientes sobre la heterogeneidad de las células piramidales en L3 26. Por último, observamos dos neuronas L5 con morfologías muy diferentes: una célula (célula f) presenta una morfología simple con dendritas apicales que terminan en el borde de L3 y L4, y otra célula piramidal bastante más grande (célula g) con una estructura basal muy compleja. dendrita y dos troncos dendríticos apicales, con un tronco que termina en L3 superior y el otro que se proyecta hacia L3 inferior antes de su terminación abrupta debido a corte o truncamiento óptico.
Si bien observamos que nuestras morfologías L5 humanas son diferentes de las informadas por Beaulieu-Laroche et al. 3 que se dirigía a las raras células piramidales L5 de mechones gruesos 25 con mechones que llegaban a L1 28 , nuestras morfologías celulares son consistentes con otros informes previos de que relativamente pocas neuronas L5 tienen dendritas que se extienden más allá de L3 1 . Además, dado el desafío del posible truncamiento de dendritas al preparar cortes que contienen células tan grandes 1 , es posible que nuestras morfologías representativas de L5 en la Fig. 1 se hayan truncado inadvertidamente 1. Sin embargo, solo observamos un truncamiento visible en una rama de una celda (la celda más grande, la celda g) y ningún truncamiento obvio en las otras celdas que se muestran en la Fig. 1 .
A continuación, evaluamos las propiedades de la membrana pasiva (es decir, el potencial de membrana en reposo (RMP), la resistencia de entrada y la constante de tiempo de la membrana) de las células piramidales corticales humanas en L2 y 3, L3c y L5 ( n = 56, n = 15 y n = 105 ). neuronas, respectivamente) usando pasos de corriente hiperpolarizantes en el modo de abrazadera de corriente (ver "Métodos"). Encontramos que las propiedades de la membrana pasiva diferían significativamente entre las células piramidales de L2 y 3, L3c y L5. Además, encontramos que las neuronas L3c y L5 tenían RMP más despolarizadas en relación con las neuronas L2 y 3 (L2 y 3: −68,2 ± 5,3 mV, L3c: −65,6 ± 3,8 mV, L5: −65,6 ± 6,5 mV; Fig. 1b ), con neuronas L5 significativamente más despolarizadas en reposo en comparación con las neuronas L2 y 3 ( p = 0,007). También encontramos que las células piramidales L5 mostraron mayores resistencias de entrada en relación con las neuronas L2 y 3 y L3c (L2 y 3: 83 ± 38,1, L3c: 79,4 ± 21,4, L5: 94,2 ± 41,3 MΩ; Fig. 1c ). Esta diferencia no fue significativa entre capas ( p = 0,110). Las células piramidales L5 y L3c también tenían constantes de tiempo de membrana más lentas ( τ m ) en comparación con L2 y 3 (L2 y 3: 13,7 ± 7,1, L3c: 17,1 ± 5,7, L5: 19,3 ± 9,1 ms, p < 0,0001; Fig. 1d ).
En general, encontramos una heterogeneidad electrofisiológica considerable entre las neuronas muestreadas dentro de cada capa cortical, en gran medida consistente con las reconstrucciones morfológicas que se muestran en la Fig. 1a . Por ejemplo, encontramos que las celdas piramidales en L5 tenían resistencias de entrada tan bajas como 20 MΩ y tan altas como 200 MΩ, lo que posiblemente refleja la dicotomía entre las celdas piramidales de mechones gruesos y delgados y/o la variación gradual entre las celdas piramidales de diferentes tamaños. y complejidades dendríticas (así como el posible corte involuntario de las dendritas durante la preparación de cortes, consulte "Discusión").
Además, comparamos estos hallazgos con conjuntos de datos publicados y disponibles públicamente de células piramidales humanas. Observamos que la resistencia de entrada promedio entre nuestra población de células piramidales L5 registradas es considerablemente más alta que la informada en Beaulieu-Laroche et al. 3 , muy probablemente debido a las diferencias en las neuronas objetivo de las grabaciones entre nuestros estudios. También utilizamos un conjunto de datos de acceso público de 272 células piramidales muestreadas de L2, L3 y L5 de una cohorte adicional de 39 pacientes quirúrgicos humanos caracterizados por el Instituto Allen de Ciencias del Cerebro ( http://celltypes.brain-map.org /). Observamos que, si bien el diseño experimental general del conjunto de datos del Instituto Allen es similar al nuestro, existen algunas diferencias metodológicas, como la composición de las soluciones utilizadas para la preparación y el registro de cortes (ver "Métodos"). Los datos del Instituto Allen generalmente son consistentes con nuestro hallazgo de que las resistencias de entrada en las células piramidales L5 no son más pequeñas que las muestreadas en L2 y L3 humanos (Fig. 1a complementaria ) y que esta tendencia se mantiene incluso en las neuronas donde las dendritas primarias no están visiblemente truncadas (Fig. 1b complementaria ). Además, observamos que, si bien parece que las neuronas L5 tienen una mayor variabilidad en estas propiedades intrínsecas en relación con L2 y 3, los niveles de heterogeneidad son consistentes con informes anteriores de L2 y 3 en estudios humanos anteriores 4, 26 , 27
Propiedades subumbrales de membrana activa de células piramidales en L2 y 3, L3c y L5
Para analizar el voltaje de caída y la despolarización de rebote, inyectamos una serie de corrientes hiperpolarizantes (L2 y 3: n = 56, L3c: n = 15, L5: n = 105). Las células piramidales L5 tenían amplitudes de voltaje de caída significativamente mayores que las células piramidales L2 y 3 (L2 y 3: 1,7 ± 1,1 mV, L3c: 2,3 ± 0,7 mV, L5: 3,2 ± 1,9 mV, p < 0,0001 entre L2 y 3 y L5; Fig. 2a, b ). Encontramos resultados similares utilizando la medida de relación de hundimiento adimensional que normaliza las diferencias de resistencia de entrada entre las neuronas (Fig. 2a complementaria ). Observamos que la relación de hundimiento se correlaciona positivamente con las amplitudes de hundimiento (Fig. 3 complementaria , r = 0,68). Estos resultados se replicaron aún más a partir del conjunto de datos del Instituto Allen (Fig. 4 complementaria ; L2: 0,51 ± 0,045; L3: 0,125 ± 0,067; L5: 0,149 ± 0,072; p = 2,21 × 10 −6 entre L2 y L3, p = 0,012 entre L2 y L3). L3 y L5). Estos hallazgos respaldan la evidencia reciente de una correlación positiva entre la amplitud del voltaje de caída y la distancia desde la superficie pial 4 , y nuestros resultados extienden aún más esta relación a L5.
Fig. 2: Las propiedades de membrana relacionadas con Ih son más evidentes en las células piramidales L5 en comparación con L2&3 y L3c .
un barrido de voltaje de ejemplo de una celda piramidal L5 representativa durante la inyección de un paso de corriente hiperpolarizante de −400 pA. Las flechas indican el voltaje de caída y la despolarización de rebote y el pico de rebote posterior a la hiperpolarización . b , c Amplitud de tensión de caída ( p < 0,0001; ANOVA post hoc de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunn, L2&3 ( n = 56), L3c ( n = 15) y L5 ( n = 105)) ( b ) y rebote amplitud de despolarización ( p < 0,0001; ANOVA post hoc de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunn, L2&3 ( n = 56), L3c ( n = 15) y L5 ( n = 105)) ( c) entre células piramidales L2&3, L3c y L5 muestreadas en respuesta a la inyección de corriente hiperpolarizante. Las líneas y las barras de error indican la media y la desviación estándar y los asteriscos indican la importancia de la comparación de grupos. d Ejemplo de barridos de voltaje en la línea de base (rojo, verde y azul) y después de la aplicación del baño (púrpura) del bloqueador I h ZD7288 (10 µM) después de la inyección de −400 pA. e , f La aplicación de baño de ZD7288 disminuyó la amplitud del voltaje de caída (L2 y 3-ZD: p = 0,001, n = 13; L3c-ZD: p = 0,125, n = 4; L5-ZD: p = 0,002, n = 10; Wilcoxon emparejado prueba de rango con signo de pares) ( e) y amplitud de despolarización de rebote (L2 y 3-ZD: p = 0,002, n = 13; L3c-ZD: p = 0,125, n = 4; L5-ZD: p = 0,002, n = 10; prueba de rango con signo de pares emparejados de Wilcoxon) ( f ) en todas las capas. *** denota p ≤ 0,001 y ** denota p = 0,002. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.
Además, el 21,9% de las neuronas L5 exhibieron picos de rebote después de la terminación de un pulso de corriente hiperpolarizante, mientras que el 1,8% de las neuronas L2 y 3 exhibieron picos de rebote, y no se observaron picos de rebote en las neuronas L3c. La amplitud de despolarización de rebote fue significativamente mayor en las células piramidales L5 en comparación con las neuronas L2&3 y L3c (L2&3: 1,8 ± 1,6 mV, L3c: 2,9 ± 1,8 mV, L5: 4,2 ± 3 mV, p < 0,0001 entre L2&3 y L5; Fig. 2c ). siga leyendo... ..... https://www.nature.com/articles/s41467-021-22741-9#Tab1
Hola amigos: A VUELO DE UN QUINDE EL BLOG., el Mal de Párkinson o enfermedad de Párkinson, el mal silencioso causado por la degeneración de las neuronas; recientes estudios realizado a los tejidos cerebrales humanos, encontraron que un subtipo ubicado en el nivel ventral de la negra pars compacta (SNpc), se encontraba con frecuencia ausente en los cerebros de las personas con la enfermedad de Párkinson.... siga leyendo................
Los resultados de la investigación, realizada en tejidos cerebrales humanos, han identificado el subtipo específico de neuronas liberadoras de dopamina más vulnerables a la enfermedad, abriendo la posibilidad futura de tratamientos más específicos.
El párkinson se caracteriza por movimientos lentos, temblores, rigidez y problemas de equilibrio y coordinación
Editor y periodista especializado en ciencia y naturaleza
La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por movimientos lentos, temblores, rigidez y problemas de equilibrio y coordinación. En la actualidad, es sabido que esta enfermedad es causada por la degeneración de las neuronas ubicadas en una parte del mesencéfalo conocida como sustancia negra pars compacta (SNpc). Es en esta parte de nuestro cerebro que se libera la dopamina, una molécula que actúa como mensajero químico o neurotransmisor controlando diferentes funciones, como las respuestas motoras o las emociones.
Sin embargo, el proceso por el cual estas neuronas degeneran selectivamente sigue siendo una incógnita a día de hoy y uno de los motivos por los cuales no existe todavía un tratamiento que retrase este proceso. Por ello, para trata de averiguar como se estaba viendo afectada esta población de neuronas, el profesor de la Harvard Medical School, Evan Macosko, y sus colegas, aislaron un conjunto de 22.048 neuronas dopaminérgicas procedentes de muestras de cerebro humano y midieron su expresión génica.
Posteriormente, al comparar los resultados de las personas con la enfermedad de Parkinson con los de las personas no afectadas por esta, los autores encontraron que un subtipo ubicado en el nivel ventral de la SNpc se encontraba con frecuencia ausente en los cerebros de las personas con la enfermedad de Parkinson. Esto apunta, según los autores, a que estas neuronas son las más vulnerables a la enfermedad. Pero eso no es todo: este subconjunto de neuronas dopaminérgica también mostró la cantidad más alta de genes que confieren el riesgo de desarrollar la enfermedad de Parkinson, lo que proporciona una posible explicación de su vulnerabilidad.
Los resultados sugieren que la enfermedad de Parkinson puede ser causada por la pérdida de un subconjunto particular de neuronas de dopamina en lugar de afectar a toda la población de neuronas por igual. Los autores concluyen que, a medida que se aprenda más sobre este subtipo de neuronas, será posible desarrollar tratamientos para la enfermedad de Parkinson que se dirijan específicamente a ellas.
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La pérdida de neuronas de dopamina (DA) dentro de la sustancia negra pars compacta (SNpc) es un sello patológico definitorio de la enfermedad de Parkinson (EP). Sin embargo, las características moleculares asociadas con la vulnerabilidad de las neuronas DA aún no se han identificado por completo. Aquí, desarrollamos un protocolo para enriquecer y perfilar transcripcionalmente las neuronas DA de pacientes con EP y controles emparejados, muestreando un total de 387.483 núcleos, incluidos 22.048 perfiles de neuronas DA. Identificamos diez poblaciones y localizamos espacialmente cada una dentro del SNpc usando Slide-seq. Un solo subtipo, marcado por la expresión del gen AGTR1 y confinado espacialmente al nivel ventral de SNpc, fue altamente susceptible a la pérdida en la EP y mostró la regulación positiva más fuerte de los objetivos de TP53 y NR2F2., nominando procesos moleculares asociados a la degeneración. Esta misma población vulnerable se enriqueció específicamente por el riesgo hereditario asociado con la EP, lo que destaca la importancia de los procesos intrínsecos de las células para determinar la vulnerabilidad diferencial de las neuronas DA a la degeneración asociada a la EP.
Principal
La degeneración de las neuronas DA del mesencéfalo dentro de la SNpc es un sello patológico de la EP y la demencia con cuerpos de Lewy (LBD) 1 . Sin embargo, se observa que algunas neuronas SNpc sobreviven incluso en las últimas etapas de estas enfermedades 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , lo que sugiere una vulnerabilidad diferencial a la degeneración. Una comprensión más clara de las características moleculares específicas de las neuronas vulnerables y la cascada asociada de eventos moleculares que conducen a su desaparición podría brindar oportunidades para refinar los modelos de laboratorio de la enfermedad de Parkinson y ayudar en el desarrollo de modificaciones de la enfermedad o específicas del tipo de célula. terapias 8 .
Los avances recientes en la tecnología de secuenciación de ARN de una sola célula 9 , 10 , 11 y su aplicación al cerebro humano post mórtem han comenzado a revelar cambios específicos del tipo de célula en varias enfermedades cerebrales 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Si bien algunos estudios han perfilado el SNpc humano con una resolución de una sola célula 17 , 18 , 19 , 20 , la proporción y el número absoluto de neuronas DA muestreadas ha sido pequeño, considerablemente más bajo que en el SNpc murino, lo que dificulta la identificación de subpoblaciones definidas molecularmente y comparar sólidamente entre sujetos.
Aquí, desarrollamos un protocolo para el enriquecimiento selectivo de neuronas DA de SNpc humano post mortem y lo usamos para definir diez poblaciones transcripcionalmente distintas mediante secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq). Luego, localizamos espacialmente estas poblaciones a lo largo del eje dorsal-ventral del SNpc utilizando Slide-seq, una tecnología de transcriptómica espacial de alta resolución. Curiosamente, encontramos que una población, marcada por la expresión de AGTR1 , estaba muy localizada ventralmente, en consonancia con los patrones previamente identificados de pérdida de neuronas DA en la EP 21. El análisis adicional de snRNA-seq de tejido post mortem de pacientes con EP confirmó la pérdida selectiva de esta población en la EP. Críticamente, la firma transcripcional de estas células vulnerables a la enfermedad de Parkinson se enriqueció mucho para la expresión de loci asociados con la enfermedad de Parkinson mediante estudios previos de la Asociación de todo el genoma (GWA). Estos resultados de enriquecimiento sugieren que los mecanismos moleculares intrínsecos de la célula juegan un papel importante en la vulnerabilidad selectiva de algunas poblaciones de neuronas DA a la degeneración de la EP.
Resultados
Una taxonomía molecular de las neuronas DA SNpc humanas
Para abordar el desafío de muestreo asociado con el perfil de neuronas DA, desarrollamos un protocolo basado en la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS), para enriquecer los núcleos de neuronas DA del mesencéfalo para su uso en snRNA-seq (Fig. 1a ). En un conjunto de datos scRNA-seq del mesencéfalo de ratón 22 (Datos extendidos Fig. 1a ), identificamos el gen Nr4a2 que codifica un factor de transcripción (TF) como específico de las neuronas DA del mesencéfalo de mamíferos (área bajo la curva (AUC) = 0,76; Métodos ) . Para perfilar de manera integral todos los tipos de células en el SNpc, aislamos núcleos de ocho donantes neurotípicos (Tabla complementaria 1 ) y realizamos snRNA-seq en núcleos tanto positivos como negativos para NR4A2 (Fig.1b ). En total, generamos 184 673 perfiles de alta calidad (número medio de identificadores moleculares únicos (UMI) por individuo, 8810; número medio de genes por individuo, 3590 (Datos ampliados Fig. 1c, d ); número medio de UMI por celda, 8086, número medio de genes por célula, 3462 (datos extendidos Fig. 1e,f )), 43,6 % de los cuales procedían de la puerta de citometría positiva para NR4A2 ( Métodos y Fig. 1b ). Realizamos un análisis de agrupamiento de cada donante por separado para asignar perfiles a una de las siete clases de células principales, incluidas las neuronas DA ( Métodos y datos extendidos Fig. 1g-j ). El NR4A2Los perfiles ordenados se enriquecieron 70 veces para las neuronas DA (Fig. 1c ), definidos por un grupo con expresión conjunta de TH , SLC6A3 y SLC18A2 (Datos extendidos Fig. 1i, j ), genes cuyos productos son esenciales para la neurotransmisión DA 23 .
Fig. 1: Un censo molecular de neuronas DA en la sustancia negra humana.
a , estrategia de enriquecimiento basada en anticuerpos NR4A2 y flujo de trabajo de creación de perfiles de snRNA-seq. b , representación UMAP de 104.097 NR4A2 – (izquierda) y 80.576 NR4A2 + (medio) núcleos de ocho donantes neurotípicos. Los perfiles de color verde son de grupos identificados como neuronas DA. c , gráfico de barras de las proporciones de neuronas DA por réplica para bibliotecas NR4A2 – frente a NR4A2 + (mediana de enriquecimiento, 70; n = 21 NR4A2 + y n = 16 bibliotecas NR4A2 - ). d, Representación UMAP de 15.684 núcleos de neuronas DA, coloreados por tipo de célula. e , Diagrama de puntos que muestra la expresión de genes marcadores seleccionados en grupos de DA. f , Dendrograma que muestra las relaciones filogenéticas entre las muestras de cinco especies en este estudio. Las ramas rojas y azules indican especies de primates y no primates, respectivamente. g , representación UMAP de 6253 núcleos de neuronas DA (3400 núcleos de primates y 2853 células de no primates), coloreados por especie (izquierda), identidad de grupo (centro) y primate versus no primate (derecha). h , Gráfica de barras apiladas que muestra la proporción de perfiles de primates (barras rojas) en cada grupo. i , Mapa de calor de la actividad del regulón escalado, según lo determinado por SCENIC ( Métodos), para los tres principales regulones expresados diferencialmente por subtipo DA. La negrita indica los TF previamente identificados como importantes para la diferenciación de DA en el mesencéfalo.
Para identificar los subtipos de neuronas DA, realizamos LIGER 17 en 5684 núcleos de neuronas DA de alta calidad, un aumento de 180 veces en números absolutos sobre los conjuntos de datos existentes de neuronas DA del cerebro medio humano (Datos extendidos Fig. 2a ). Con base en nuestra incorporación de baja dimensión derivada de LIGER (Datos extendidos Fig. 2b ), identificamos diez subpoblaciones transcripcionalmente distintas ( Métodos , Fig. 1d, e y Datos extendidos Fig. 2c ) con una fuerte alineación en todos los donantes ( Métodos ; alineación puntuación, 0,98; datos ampliados Fig. 2d ). Cuatro grupos de DA expresaron preferentemente SOX6 mientras que los otros seis expresaron CALB1, recapitulando un eje de desarrollo de variación bien definido dentro de las neuronas DA del mesencéfalo (Fig. 1e ) 24 . Todos nuestros subtipos mostraron una fuerte expresión de genes que son esenciales para la neurotransmisión DA (Datos extendidos Fig. 2e ) 23 . Los marcadores dopaminérgicos previamente definidos 20 también mostraron una fuerte expresión en nuestro conjunto de datos, con una expresión mixta de marcadores de subtipo encontrados previamente que diferencian diferentes poblaciones de roedores (Datos extendidos Fig. 2e ) 20 . Además, las proporciones de estos amplios subtipos generalmente coincidían con las estimaciones estereotácticas de células CALB1 + de tinciones inmunohistoquímicas anteriores de nigra humana post mortem.21 (Datos extendidos Fig. 2f ), lo que sugiere que no hay sesgo intrínseco en nuestro método de muestreo de tejido. El amplio eje de variación CALB1 – SOX6 fue consistente entre los donantes (Datos extendidos Fig. 2g ) y los grupos se representaron consistentemente a través de las herramientas integradoras (Datos extendidos Fig. 2h–j y Métodos ), lo que sugiere que nuestra estrategia descubrió y preservó constantemente los estados biológicos subyacentes. .
Nuestro método para el perfilado de alto rendimiento de los subtipos de DA nos permitió hacer comparaciones sólidas entre las neuronas de pars compacta DA en todas las especies. Aunque estudios recientes de perfiles de primates han mostrado una fuerte conservación evolutiva de los tipos de células en ratones, se han informado algunas especializaciones específicas de primates 25 , 26 . Para investigar la conservación evolutiva de nuestros subtipos de neuronas DA humanas, muestreamos e integramos, con nuestros conjuntos de datos humanos, perfiles de neuronas DA de cuatro especies adicionales que abarcan tres órdenes filogenéticos: primates, escandentes y roedores (Fig. 1f ). El análisis de especies cruzadas ( Métodos ) identificó ocho grupos (Fig. 1g ) que siguieron consistentemente el SOX6 :Eje de variación CALB1 (datos extendidos Fig. 3a–c ). Si bien algunos perfiles exhibieron divergencia en proporciones celulares, el análisis integrador mantuvo en gran medida las distinciones de grupos encontradas en el análisis solo para humanos (Datos extendidos Fig. 3d ). Al examinar las contribuciones de cada especie a cada grupo, encontramos que la población DA8, compuesta principalmente por la población humana CALB1_GEM (Datos extendidos Fig. 3d ), incluía perfiles derivados solo de humanos y macacos (Fig. 1g, h ), y expresó una serie de genes marcadores altamente específicos que no se encuentran en ningún otro subtipo de DA en nuestro análisis integrador (Datos extendidos Fig. 3e ) y ausentes en un análisis previo de subtipos de DA de roedores (Datos extendidos Fig.3f ) 23 . Usando la hibridación in situ en el cerebro medio del ratón ( Métodos ), no encontramos neuronas DA murinas que expresaran los genes marcadores Fam83b y Gem para nuestra población DA8 (Datos extendidos Fig. 3g-i ), lo que confirma aún más la falta de una población afín en roedores.
Identificación de elementos reguladores en neuronas dopaminérgicas
La identificación de los elementos reguladores que impulsan la identidad molecular de las neuronas DA puede informar los protocolos de diferenciación para los estudios in vitro de las neuronas DA en la EP, así como impulsar el perfeccionamiento de las terapias de reemplazo celular para esta enfermedad. Para comprender las redes reguladoras que pueden impulsar dicha variación transcripcional, utilizamos la inferencia y el agrupamiento de redes reguladoras de una sola célula (SCENIC) para identificar 84 regulones que eran altamente específicos ( P ajustada < 0,05 y AUC > 0,7, prueba de suma de rangos de Wilcoxon; Métodos ) a los diez subtipos de DA definidos en nuestro conjunto de datos. Los TF principales clasificados por AUC por subtipo de DA contenían muchos TF previamente implicados en la especificación de la identidad de DA, incluidos los codificados por los genes SOX6 , OTX2 ,SMAD1 , PBX1 , LMX1B , NFE2L1 y EN2 (Fig. 1i y Datos extendidos Fig. 4a ) 27 . Incluso dentro del eje SOX6 más homogéneo , identificamos varios TF con actividad diferencial entre subtipos, incluido el TF codificado por SMAD1 , así como algunos que no estaban previamente implicados en la diferenciación de neuronas DA, como los codificados por CUX2 y ZNF91 . El mismo análisis SCENIC sobre los datos de las neuronas DA generados a partir del mesencéfalo del macaco (Datos ampliados Fig. 4b) identificaron conjuntos de regulones altamente superpuestos, lo que corrobora aún más la identificación de TF selectivamente activos en cada subtipo de DA.
Localización de neuronas DA en cerebro medio de macaco por Slide-seq
Las neuronas dopaminérgicas en el SNpc comprenden el grupo A9 de neuronas catecolaminérgicas y se dividen en niveles dorsal y ventral, mostrando el nivel ventral una mayor vulnerabilidad a la degeneración asociada a la EP 6 , 21 , 28 , 29 , 30 . Para localizar espacialmente las diez poblaciones de DA definidas en nuestro análisis humano (Fig. 1d ), realizamos Slide-seq 31 , 32 en 27 matrices generadas a partir de nueve secciones coronales que abarcan el 80 % caudal del eje rostralcaudal de una Macaca fascicularis SNpc ( Métodos , Fig. 2a y datos extendidos Fig. 5a,b). El grupo A9 fue fácilmente identificable al visualizar la expresión de los marcadores de neuronas DA TH y SLC6A3 (Datos extendidos Fig. 5c ). Usando una herramienta descrita recientemente para la descomposición de mezclas de tipos de células en datos de transcriptómica espacial 33 ( Métodos ), localizamos nuestros diez subtipos de DA en 3,206 ubicaciones de cuentas definidas por Slide-seq en el grupo A9 (Fig. 2d , Datos extendidos Fig. 5d y Methods ) y colocados cada uno en relación con la demarcación entre los niveles dorsal y ventral (Fig. 2e , línea punteada), definidos a partir de la expresión de CALB1 y ALDH1A1 (Fig.5c–e ) 21 . La población SOX6_AGTR1 fue la más fuertemente enriquecida en el nivel ventral (Fig. 2d, e y Datos extendidos Fig. 5f-h ; distancia relativa media de SOX6_AGTR1, +490 μm), de acuerdo con los análisis de marcadores anteriores realizados en subconjuntos de microdisección de captura con láser de A9 DA neuronas 34 , mientras que las poblaciones CALB1_GEM y CALB1_TRHR estaban fuertemente enriquecidas en el nivel dorsal (Fig. 2d,e y datos extendidos Fig. 5f-h ; distancia relativa media de CALB1_GEM, −478 μm; distancia relativa media de CALB1_TRHR, −288 μm ). Hibridación in situ con fluorescencia de molécula única (smFISH) (Datos extendidos Fig. 6a y Métodos) del mesencéfalo humano confirmó la localización del subtipo SOX6_AGTR1 en el nivel ventral (Fig. 2f,g y Datos extendidos Fig. 6b ) y los tipos CALB1_GEM y CALB1_TRHR en el nivel dorsal (Fig. 2f,g y Datos extendidos Fig. 6c, d ). Los análisis in situ adicionales de otras dos poblaciones SOX6 + confirmaron su falta de localización selectiva en cualquiera de los niveles (Datos extendidos Fig. 6e-h ), de acuerdo con los resultados de Slide-seq (Fig. 2e )...... siga leyendo...................................
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