Los resultados de la investigación, realizada en tejidos cerebrales humanos, han identificado el subtipo específico de neuronas liberadoras de dopamina más vulnerables a la enfermedad, abriendo la posibilidad futura de tratamientos más específicos.
El párkinson se caracteriza por movimientos lentos, temblores, rigidez y problemas de equilibrio y coordinación
La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por movimientos lentos, temblores, rigidez y problemas de equilibrio y coordinación. En la actualidad, es sabido que esta enfermedad es causada por la degeneración de las neuronas ubicadas en una parte del mesencéfalo conocida como sustancia negra pars compacta (SNpc). Es en esta parte de nuestro cerebro que se libera la dopamina, una molécula que actúa como mensajero químico o neurotransmisor controlando diferentes funciones, como las respuestas motoras o las emociones.
Sin embargo, el proceso por el cual estas neuronas degeneran selectivamente sigue siendo una incógnita a día de hoy y uno de los motivos por los cuales no existe todavía un tratamiento que retrase este proceso. Por ello, para trata de averiguar como se estaba viendo afectada esta población de neuronas, el profesor de la Harvard Medical School, Evan Macosko, y sus colegas, aislaron un conjunto de 22.048 neuronas dopaminérgicas procedentes de muestras de cerebro humano y midieron su expresión génica.
Su investigación, la cual se publica esta semana en la revista Nature Neuroscience bajo el título Single-cell genomic profiling of human dopamine neurons identifies a population that selectively degenerates in Parkinson’s disease les llevó a descubrir hasta 10 subtipos distintos de neuronas dopaminérgicas distintas.
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Posteriormente, al comparar los resultados de las personas con la enfermedad de Parkinson con los de las personas no afectadas por esta, los autores encontraron que un subtipo ubicado en el nivel ventral de la SNpc se encontraba con frecuencia ausente en los cerebros de las personas con la enfermedad de Parkinson. Esto apunta, según los autores, a que estas neuronas son las más vulnerables a la enfermedad. Pero eso no es todo: este subconjunto de neuronas dopaminérgica también mostró la cantidad más alta de genes que confieren el riesgo de desarrollar la enfermedad de Parkinson, lo que proporciona una posible explicación de su vulnerabilidad.
Los resultados sugieren que la enfermedad de Parkinson puede ser causada por la pérdida de un subconjunto particular de neuronas de dopamina en lugar de afectar a toda la población de neuronas por igual. Los autores concluyen que, a medida que se aprenda más sobre este subtipo de neuronas, será posible desarrollar tratamientos para la enfermedad de Parkinson que se dirijan específicamente a ellas.
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Resumen
La pérdida de neuronas de dopamina (DA) dentro de la sustancia negra pars compacta (SNpc) es un sello patológico definitorio de la enfermedad de Parkinson (EP). Sin embargo, las características moleculares asociadas con la vulnerabilidad de las neuronas DA aún no se han identificado por completo. Aquí, desarrollamos un protocolo para enriquecer y perfilar transcripcionalmente las neuronas DA de pacientes con EP y controles emparejados, muestreando un total de 387.483 núcleos, incluidos 22.048 perfiles de neuronas DA. Identificamos diez poblaciones y localizamos espacialmente cada una dentro del SNpc usando Slide-seq. Un solo subtipo, marcado por la expresión del gen AGTR1 y confinado espacialmente al nivel ventral de SNpc, fue altamente susceptible a la pérdida en la EP y mostró la regulación positiva más fuerte de los objetivos de TP53 y NR2F2., nominando procesos moleculares asociados a la degeneración. Esta misma población vulnerable se enriqueció específicamente por el riesgo hereditario asociado con la EP, lo que destaca la importancia de los procesos intrínsecos de las células para determinar la vulnerabilidad diferencial de las neuronas DA a la degeneración asociada a la EP.
Principal
La degeneración de las neuronas DA del mesencéfalo dentro de la SNpc es un sello patológico de la EP y la demencia con cuerpos de Lewy (LBD) 1 . Sin embargo, se observa que algunas neuronas SNpc sobreviven incluso en las últimas etapas de estas enfermedades 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , lo que sugiere una vulnerabilidad diferencial a la degeneración. Una comprensión más clara de las características moleculares específicas de las neuronas vulnerables y la cascada asociada de eventos moleculares que conducen a su desaparición podría brindar oportunidades para refinar los modelos de laboratorio de la enfermedad de Parkinson y ayudar en el desarrollo de modificaciones de la enfermedad o específicas del tipo de célula. terapias 8 .
Los avances recientes en la tecnología de secuenciación de ARN de una sola célula 9 , 10 , 11 y su aplicación al cerebro humano post mórtem han comenzado a revelar cambios específicos del tipo de célula en varias enfermedades cerebrales 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Si bien algunos estudios han perfilado el SNpc humano con una resolución de una sola célula 17 , 18 , 19 , 20 , la proporción y el número absoluto de neuronas DA muestreadas ha sido pequeño, considerablemente más bajo que en el SNpc murino, lo que dificulta la identificación de subpoblaciones definidas molecularmente y comparar sólidamente entre sujetos.
Aquí, desarrollamos un protocolo para el enriquecimiento selectivo de neuronas DA de SNpc humano post mortem y lo usamos para definir diez poblaciones transcripcionalmente distintas mediante secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq). Luego, localizamos espacialmente estas poblaciones a lo largo del eje dorsal-ventral del SNpc utilizando Slide-seq, una tecnología de transcriptómica espacial de alta resolución. Curiosamente, encontramos que una población, marcada por la expresión de AGTR1 , estaba muy localizada ventralmente, en consonancia con los patrones previamente identificados de pérdida de neuronas DA en la EP 21. El análisis adicional de snRNA-seq de tejido post mortem de pacientes con EP confirmó la pérdida selectiva de esta población en la EP. Críticamente, la firma transcripcional de estas células vulnerables a la enfermedad de Parkinson se enriqueció mucho para la expresión de loci asociados con la enfermedad de Parkinson mediante estudios previos de la Asociación de todo el genoma (GWA). Estos resultados de enriquecimiento sugieren que los mecanismos moleculares intrínsecos de la célula juegan un papel importante en la vulnerabilidad selectiva de algunas poblaciones de neuronas DA a la degeneración de la EP.
Resultados
Una taxonomía molecular de las neuronas DA SNpc humanas
Para abordar el desafío de muestreo asociado con el perfil de neuronas DA, desarrollamos un protocolo basado en la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS), para enriquecer los núcleos de neuronas DA del mesencéfalo para su uso en snRNA-seq (Fig. 1a ). En un conjunto de datos scRNA-seq del mesencéfalo de ratón 22 (Datos extendidos Fig. 1a ), identificamos el gen Nr4a2 que codifica un factor de transcripción (TF) como específico de las neuronas DA del mesencéfalo de mamíferos (área bajo la curva (AUC) = 0,76; Métodos ) . Para perfilar de manera integral todos los tipos de células en el SNpc, aislamos núcleos de ocho donantes neurotípicos (Tabla complementaria 1 ) y realizamos snRNA-seq en núcleos tanto positivos como negativos para NR4A2 (Fig.1b ). En total, generamos 184 673 perfiles de alta calidad (número medio de identificadores moleculares únicos (UMI) por individuo, 8810; número medio de genes por individuo, 3590 (Datos ampliados Fig. 1c, d ); número medio de UMI por celda, 8086, número medio de genes por célula, 3462 (datos extendidos Fig. 1e,f )), 43,6 % de los cuales procedían de la puerta de citometría positiva para NR4A2 ( Métodos y Fig. 1b ). Realizamos un análisis de agrupamiento de cada donante por separado para asignar perfiles a una de las siete clases de células principales, incluidas las neuronas DA ( Métodos y datos extendidos Fig. 1g-j ). El NR4A2Los perfiles ordenados se enriquecieron 70 veces para las neuronas DA (Fig. 1c ), definidos por un grupo con expresión conjunta de TH , SLC6A3 y SLC18A2 (Datos extendidos Fig. 1i, j ), genes cuyos productos son esenciales para la neurotransmisión DA 23 .
Fig. 1: Un censo molecular de neuronas DA en la sustancia negra humana.
a , estrategia de enriquecimiento basada en anticuerpos NR4A2 y flujo de trabajo de creación de perfiles de snRNA-seq. b , representación UMAP de 104.097 NR4A2 – (izquierda) y 80.576 NR4A2 + (medio) núcleos de ocho donantes neurotípicos. Los perfiles de color verde son de grupos identificados como neuronas DA. c , gráfico de barras de las proporciones de neuronas DA por réplica para bibliotecas NR4A2 – frente a NR4A2 + (mediana de enriquecimiento, 70; n = 21 NR4A2 + y n = 16 bibliotecas NR4A2 - ). d, Representación UMAP de 15.684 núcleos de neuronas DA, coloreados por tipo de célula. e , Diagrama de puntos que muestra la expresión de genes marcadores seleccionados en grupos de DA. f , Dendrograma que muestra las relaciones filogenéticas entre las muestras de cinco especies en este estudio. Las ramas rojas y azules indican especies de primates y no primates, respectivamente. g , representación UMAP de 6253 núcleos de neuronas DA (3400 núcleos de primates y 2853 células de no primates), coloreados por especie (izquierda), identidad de grupo (centro) y primate versus no primate (derecha). h , Gráfica de barras apiladas que muestra la proporción de perfiles de primates (barras rojas) en cada grupo. i , Mapa de calor de la actividad del regulón escalado, según lo determinado por SCENIC ( Métodos), para los tres principales regulones expresados diferencialmente por subtipo DA. La negrita indica los TF previamente identificados como importantes para la diferenciación de DA en el mesencéfalo.
Para identificar los subtipos de neuronas DA, realizamos LIGER 17 en 5684 núcleos de neuronas DA de alta calidad, un aumento de 180 veces en números absolutos sobre los conjuntos de datos existentes de neuronas DA del cerebro medio humano (Datos extendidos Fig. 2a ). Con base en nuestra incorporación de baja dimensión derivada de LIGER (Datos extendidos Fig. 2b ), identificamos diez subpoblaciones transcripcionalmente distintas ( Métodos , Fig. 1d, e y Datos extendidos Fig. 2c ) con una fuerte alineación en todos los donantes ( Métodos ; alineación puntuación, 0,98; datos ampliados Fig. 2d ). Cuatro grupos de DA expresaron preferentemente SOX6 mientras que los otros seis expresaron CALB1, recapitulando un eje de desarrollo de variación bien definido dentro de las neuronas DA del mesencéfalo (Fig. 1e ) 24 . Todos nuestros subtipos mostraron una fuerte expresión de genes que son esenciales para la neurotransmisión DA (Datos extendidos Fig. 2e ) 23 . Los marcadores dopaminérgicos previamente definidos 20 también mostraron una fuerte expresión en nuestro conjunto de datos, con una expresión mixta de marcadores de subtipo encontrados previamente que diferencian diferentes poblaciones de roedores (Datos extendidos Fig. 2e ) 20 . Además, las proporciones de estos amplios subtipos generalmente coincidían con las estimaciones estereotácticas de células CALB1 + de tinciones inmunohistoquímicas anteriores de nigra humana post mortem.21 (Datos extendidos Fig. 2f ), lo que sugiere que no hay sesgo intrínseco en nuestro método de muestreo de tejido. El amplio eje de variación CALB1 – SOX6 fue consistente entre los donantes (Datos extendidos Fig. 2g ) y los grupos se representaron consistentemente a través de las herramientas integradoras (Datos extendidos Fig. 2h–j y Métodos ), lo que sugiere que nuestra estrategia descubrió y preservó constantemente los estados biológicos subyacentes. .
Nuestro método para el perfilado de alto rendimiento de los subtipos de DA nos permitió hacer comparaciones sólidas entre las neuronas de pars compacta DA en todas las especies. Aunque estudios recientes de perfiles de primates han mostrado una fuerte conservación evolutiva de los tipos de células en ratones, se han informado algunas especializaciones específicas de primates 25 , 26 . Para investigar la conservación evolutiva de nuestros subtipos de neuronas DA humanas, muestreamos e integramos, con nuestros conjuntos de datos humanos, perfiles de neuronas DA de cuatro especies adicionales que abarcan tres órdenes filogenéticos: primates, escandentes y roedores (Fig. 1f ). El análisis de especies cruzadas ( Métodos ) identificó ocho grupos (Fig. 1g ) que siguieron consistentemente el SOX6 :Eje de variación CALB1 (datos extendidos Fig. 3a–c ). Si bien algunos perfiles exhibieron divergencia en proporciones celulares, el análisis integrador mantuvo en gran medida las distinciones de grupos encontradas en el análisis solo para humanos (Datos extendidos Fig. 3d ). Al examinar las contribuciones de cada especie a cada grupo, encontramos que la población DA8, compuesta principalmente por la población humana CALB1_GEM (Datos extendidos Fig. 3d ), incluía perfiles derivados solo de humanos y macacos (Fig. 1g, h ), y expresó una serie de genes marcadores altamente específicos que no se encuentran en ningún otro subtipo de DA en nuestro análisis integrador (Datos extendidos Fig. 3e ) y ausentes en un análisis previo de subtipos de DA de roedores (Datos extendidos Fig.3f ) 23 . Usando la hibridación in situ en el cerebro medio del ratón ( Métodos ), no encontramos neuronas DA murinas que expresaran los genes marcadores Fam83b y Gem para nuestra población DA8 (Datos extendidos Fig. 3g-i ), lo que confirma aún más la falta de una población afín en roedores.
Identificación de elementos reguladores en neuronas dopaminérgicas
La identificación de los elementos reguladores que impulsan la identidad molecular de las neuronas DA puede informar los protocolos de diferenciación para los estudios in vitro de las neuronas DA en la EP, así como impulsar el perfeccionamiento de las terapias de reemplazo celular para esta enfermedad. Para comprender las redes reguladoras que pueden impulsar dicha variación transcripcional, utilizamos la inferencia y el agrupamiento de redes reguladoras de una sola célula (SCENIC) para identificar 84 regulones que eran altamente específicos ( P ajustada < 0,05 y AUC > 0,7, prueba de suma de rangos de Wilcoxon; Métodos ) a los diez subtipos de DA definidos en nuestro conjunto de datos. Los TF principales clasificados por AUC por subtipo de DA contenían muchos TF previamente implicados en la especificación de la identidad de DA, incluidos los codificados por los genes SOX6 , OTX2 ,SMAD1 , PBX1 , LMX1B , NFE2L1 y EN2 (Fig. 1i y Datos extendidos Fig. 4a ) 27 . Incluso dentro del eje SOX6 más homogéneo , identificamos varios TF con actividad diferencial entre subtipos, incluido el TF codificado por SMAD1 , así como algunos que no estaban previamente implicados en la diferenciación de neuronas DA, como los codificados por CUX2 y ZNF91 . El mismo análisis SCENIC sobre los datos de las neuronas DA generados a partir del mesencéfalo del macaco (Datos ampliados Fig. 4b) identificaron conjuntos de regulones altamente superpuestos, lo que corrobora aún más la identificación de TF selectivamente activos en cada subtipo de DA.
Localización de neuronas DA en cerebro medio de macaco por Slide-seq
Las neuronas dopaminérgicas en el SNpc comprenden el grupo A9 de neuronas catecolaminérgicas y se dividen en niveles dorsal y ventral, mostrando el nivel ventral una mayor vulnerabilidad a la degeneración asociada a la EP 6 , 21 , 28 , 29 , 30 . Para localizar espacialmente las diez poblaciones de DA definidas en nuestro análisis humano (Fig. 1d ), realizamos Slide-seq 31 , 32 en 27 matrices generadas a partir de nueve secciones coronales que abarcan el 80 % caudal del eje rostralcaudal de una Macaca fascicularis SNpc ( Métodos , Fig. 2a y datos extendidos Fig. 5a,b). El grupo A9 fue fácilmente identificable al visualizar la expresión de los marcadores de neuronas DA TH y SLC6A3 (Datos extendidos Fig. 5c ). Usando una herramienta descrita recientemente para la descomposición de mezclas de tipos de células en datos de transcriptómica espacial 33 ( Métodos ), localizamos nuestros diez subtipos de DA en 3,206 ubicaciones de cuentas definidas por Slide-seq en el grupo A9 (Fig. 2d , Datos extendidos Fig. 5d y Methods ) y colocados cada uno en relación con la demarcación entre los niveles dorsal y ventral (Fig. 2e , línea punteada), definidos a partir de la expresión de CALB1 y ALDH1A1 (Fig.5c–e ) 21 . La población SOX6_AGTR1 fue la más fuertemente enriquecida en el nivel ventral (Fig. 2d, e y Datos extendidos Fig. 5f-h ; distancia relativa media de SOX6_AGTR1, +490 μm), de acuerdo con los análisis de marcadores anteriores realizados en subconjuntos de microdisección de captura con láser de A9 DA neuronas 34 , mientras que las poblaciones CALB1_GEM y CALB1_TRHR estaban fuertemente enriquecidas en el nivel dorsal (Fig. 2d,e y datos extendidos Fig. 5f-h ; distancia relativa media de CALB1_GEM, −478 μm; distancia relativa media de CALB1_TRHR, −288 μm ). Hibridación in situ con fluorescencia de molécula única (smFISH) (Datos extendidos Fig. 6a y Métodos) del mesencéfalo humano confirmó la localización del subtipo SOX6_AGTR1 en el nivel ventral (Fig. 2f,g y Datos extendidos Fig. 6b ) y los tipos CALB1_GEM y CALB1_TRHR en el nivel dorsal (Fig. 2f,g y Datos extendidos Fig. 6c, d ). Los análisis in situ adicionales de otras dos poblaciones SOX6 + confirmaron su falta de localización selectiva en cualquiera de los niveles (Datos extendidos Fig. 6e-h ), de acuerdo con los resultados de Slide-seq (Fig. 2e )...... siga leyendo...................................
https://www.nature.com/articles/s41593-022-01061-1 nature neuroscience
2 comentarios:
Gracias por enviar la información de las causas de ésta enfermedad.
Excelente información , gracias Chema por compartir
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