Una taxonomía molecular de las neuronas DA SNpc humanas
Para abordar el desafío de muestreo asociado con el perfil de neuronas DA, desarrollamos un protocolo basado en la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS), para enriquecer los núcleos de neuronas DA del mesencéfalo para su uso en snRNA-seq (Fig. 1a ). En un conjunto de datos scRNA-seq del mesencéfalo de ratón 22 (Datos extendidos Fig. 1a ), identificamos el gen Nr4a2 que codifica un factor de transcripción (TF) como específico de las neuronas DA del mesencéfalo de mamíferos (área bajo la curva (AUC) = 0,76; Métodos ) . Para perfilar de manera integral todos los tipos de células en el SNpc, aislamos núcleos de ocho donantes neurotípicos (Tabla complementaria 1 ) y realizamos snRNA-seq en núcleos tanto positivos como negativos para NR4A2 (Fig.1b ). En total, generamos 184 673 perfiles de alta calidad (número medio de identificadores moleculares únicos (UMI) por individuo, 8810; número medio de genes por individuo, 3590 (Datos ampliados Fig. 1c, d ); número medio de UMI por celda, 8086, número medio de genes por célula, 3462 (datos extendidos Fig. 1e,f )), 43,6 % de los cuales procedían de la puerta de citometría positiva para NR4A2 ( Métodos y Fig. 1b ). Realizamos un análisis de agrupamiento de cada donante por separado para asignar perfiles a una de las siete clases de células principales, incluidas las neuronas DA ( Métodos y datos extendidos Fig. 1g-j ). El NR4A2Los perfiles ordenados se enriquecieron 70 veces para las neuronas DA (Fig. 1c ), definidos por un grupo con expresión conjunta de TH , SLC6A3 y SLC18A2 (Datos extendidos Fig. 1i, j ), genes cuyos productos son esenciales para la neurotransmisión DA 23 .
Fig. 1: Un censo molecular de neuronas DA en la sustancia negra humana.
De: El perfil genómico unicelular de las neuronas dopaminérgicas humanas identifica una población que degenera selectivamente en la enfermedad de Parkinson
Para identificar los subtipos de neuronas DA, realizamos LIGER 17 en 5684 núcleos de neuronas DA de alta calidad, un aumento de 180 veces en números absolutos sobre los conjuntos de datos existentes de neuronas DA del cerebro medio humano (Datos extendidos Fig. 2a ). Con base en nuestra incorporación de baja dimensión derivada de LIGER (Datos extendidos Fig. 2b ), identificamos diez subpoblaciones transcripcionalmente distintas ( Métodos , Fig. 1d, e y Datos extendidos Fig. 2c ) con una fuerte alineación en todos los donantes ( Métodos ; alineación puntuación, 0,98; datos ampliados Fig. 2d ). Cuatro grupos de DA expresaron preferentemente SOX6 mientras que los otros seis expresaron CALB1, recapitulando un eje de desarrollo de variación bien definido dentro de las neuronas DA del mesencéfalo (Fig. 1e ) 24 . Todos nuestros subtipos mostraron una fuerte expresión de genes que son esenciales para la neurotransmisión DA (Datos extendidos Fig. 2e ) 23 . Los marcadores dopaminérgicos previamente definidos 20 también mostraron una fuerte expresión en nuestro conjunto de datos, con una expresión mixta de marcadores de subtipo encontrados previamente que diferencian diferentes poblaciones de roedores (Datos extendidos Fig. 2e ) 20 . Además, las proporciones de estos amplios subtipos generalmente coincidían con las estimaciones estereotácticas de células CALB1 + de tinciones inmunohistoquímicas anteriores de nigra humana post mortem.21 (Datos extendidos Fig. 2f ), lo que sugiere que no hay sesgo intrínseco en nuestro método de muestreo de tejido. El amplio eje de variación CALB1 – SOX6 fue consistente entre los donantes (Datos extendidos Fig. 2g ) y los grupos se representaron consistentemente a través de las herramientas integradoras (Datos extendidos Fig. 2h–j y Métodos ), lo que sugiere que nuestra estrategia descubrió y preservó constantemente los estados biológicos subyacentes. .
Nuestro método para el perfilado de alto rendimiento de los subtipos de DA nos permitió hacer comparaciones sólidas entre las neuronas de pars compacta DA en todas las especies. Aunque estudios recientes de perfiles de primates han mostrado una fuerte conservación evolutiva de los tipos de células en ratones, se han informado algunas especializaciones específicas de primates 25 , 26 . Para investigar la conservación evolutiva de nuestros subtipos de neuronas DA humanas, muestreamos e integramos, con nuestros conjuntos de datos humanos, perfiles de neuronas DA de cuatro especies adicionales que abarcan tres órdenes filogenéticos: primates, escandentes y roedores (Fig. 1f ). El análisis de especies cruzadas ( Métodos ) identificó ocho grupos (Fig. 1g ) que siguieron consistentemente el SOX6 :Eje de variación CALB1 (datos extendidos Fig. 3a–c ). Si bien algunos perfiles exhibieron divergencia en proporciones celulares, el análisis integrador mantuvo en gran medida las distinciones de grupos encontradas en el análisis solo para humanos (Datos extendidos Fig. 3d ). Al examinar las contribuciones de cada especie a cada grupo, encontramos que la población DA8, compuesta principalmente por la población humana CALB1_GEM (Datos extendidos Fig. 3d ), incluía perfiles derivados solo de humanos y macacos (Fig. 1g, h ), y expresó una serie de genes marcadores altamente específicos que no se encuentran en ningún otro subtipo de DA en nuestro análisis integrador (Datos extendidos Fig. 3e ) y ausentes en un análisis previo de subtipos de DA de roedores (Datos extendidos Fig.3f ) 23 . Usando la hibridación in situ en el cerebro medio del ratón ( Métodos ), no encontramos neuronas DA murinas que expresaran los genes marcadores Fam83b y Gem para nuestra población DA8 (Datos extendidos Fig. 3g-i ), lo que confirma aún más la falta de una población afín en roedores.
Identificación de elementos reguladores en neuronas dopaminérgicas
La identificación de los elementos reguladores que impulsan la identidad molecular de las neuronas DA puede informar los protocolos de diferenciación para los estudios in vitro de las neuronas DA en la EP, así como impulsar el perfeccionamiento de las terapias de reemplazo celular para esta enfermedad. Para comprender las redes reguladoras que pueden impulsar dicha variación transcripcional, utilizamos la inferencia y el agrupamiento de redes reguladoras de una sola célula (SCENIC) para identificar 84 regulones que eran altamente específicos ( P ajustada < 0,05 y AUC > 0,7, prueba de suma de rangos de Wilcoxon; Métodos ) a los diez subtipos de DA definidos en nuestro conjunto de datos. Los TF principales clasificados por AUC por subtipo de DA contenían muchos TF previamente implicados en la especificación de la identidad de DA, incluidos los codificados por los genes SOX6 , OTX2 ,SMAD1 , PBX1 , LMX1B , NFE2L1 y EN2 (Fig. 1i y Datos extendidos Fig. 4a ) 27 . Incluso dentro del eje SOX6 más homogéneo , identificamos varios TF con actividad diferencial entre subtipos, incluido el TF codificado por SMAD1 , así como algunos que no estaban previamente implicados en la diferenciación de neuronas DA, como los codificados por CUX2 y ZNF91 . El mismo análisis SCENIC sobre los datos de las neuronas DA generados a partir del mesencéfalo del macaco (Datos ampliados Fig. 4b) identificaron conjuntos de regulones altamente superpuestos, lo que corrobora aún más la identificación de TF selectivamente activos en cada subtipo de DA.
Localización de neuronas DA en cerebro medio de macaco por Slide-seq
Las neuronas dopaminérgicas en el SNpc comprenden el grupo A9 de neuronas catecolaminérgicas y se dividen en niveles dorsal y ventral, mostrando el nivel ventral una mayor vulnerabilidad a la degeneración asociada a la EP 6 , 21 , 28 , 29 , 30 . Para localizar espacialmente las diez poblaciones de DA definidas en nuestro análisis humano (Fig. 1d ), realizamos Slide-seq 31 , 32 en 27 matrices generadas a partir de nueve secciones coronales que abarcan el 80 % caudal del eje rostralcaudal de una Macaca fascicularis SNpc ( Métodos , Fig. 2a y datos extendidos Fig. 5a,b). El grupo A9 fue fácilmente identificable al visualizar la expresión de los marcadores de neuronas DA TH y SLC6A3 (Datos extendidos Fig. 5c ). Usando una herramienta descrita recientemente para la descomposición de mezclas de tipos de células en datos de transcriptómica espacial 33 ( Métodos ), localizamos nuestros diez subtipos de DA en 3,206 ubicaciones de cuentas definidas por Slide-seq en el grupo A9 (Fig. 2d , Datos extendidos Fig. 5d y Methods ) y colocados cada uno en relación con la demarcación entre los niveles dorsal y ventral (Fig. 2e , línea punteada), definidos a partir de la expresión de CALB1 y ALDH1A1 (Fig.5c–e ) 21 . La población SOX6_AGTR1 fue la más fuertemente enriquecida en el nivel ventral (Fig. 2d, e y Datos extendidos Fig. 5f-h ; distancia relativa media de SOX6_AGTR1, +490 μm), de acuerdo con los análisis de marcadores anteriores realizados en subconjuntos de microdisección de captura con láser de A9 DA neuronas 34 , mientras que las poblaciones CALB1_GEM y CALB1_TRHR estaban fuertemente enriquecidas en el nivel dorsal (Fig. 2d,e y datos extendidos Fig. 5f-h ; distancia relativa media de CALB1_GEM, −478 μm; distancia relativa media de CALB1_TRHR, −288 μm ). Hibridación in situ con fluorescencia de molécula única (smFISH) (Datos extendidos Fig. 6a y Métodos) del mesencéfalo humano confirmó la localización del subtipo SOX6_AGTR1 en el nivel ventral (Fig. 2f,g y Datos extendidos Fig. 6b ) y los tipos CALB1_GEM y CALB1_TRHR en el nivel dorsal (Fig. 2f,g y Datos extendidos Fig. 6c, d ). Los análisis in situ adicionales de otras dos poblaciones SOX6 + confirmaron su falta de localización selectiva en cualquiera de los niveles (Datos extendidos Fig. 6e-h ), de acuerdo con los resultados de Slide-seq (Fig. 2e )...... siga leyendo...................................
https://www.nature.com/articles/s41593-022-01061-1 nature neuroscience
